Molekulare und biochemische Parasitologie
Band 198, Ausgabe 2,
Dezember 2014
, Seiten 82-91
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Abstrakt
InTrypanosoma cruzi, dem Erreger der Chagas-Krankheit, werden die ersten sechs oder sieben Schritte der Glykolyse in Glykosomen unterteilt, bei denen es sich um authentische, aber spezialisierte Peroxisomen handelt. Hexokinase (HK), das erste Enzym im glykolytischen Weg, war ein wichtiges Forschungsobjekt, insbesondere als potenzielles Angriffsziel für Arzneimittel. Hier präsentieren wir die Ergebnisse einer spezifischen Kinetikstudie des nativen HK vonT. cruziEpimastigoten; Ein sigmoidales Verhalten zeigte sich, wenn die Geschwindigkeit der Reaktion als Funktion der Konzentration ihrer Substrate, Glucose und ATP, bestimmt wurde. Dieses Verhalten wurde nur bei niedrigen Enzymkonzentrationen beobachtet, während bei hohen Konzentrationen die klassische Michaelis-Menten-Kinetik auftrat. Die Verlaufskurve der Enzymaktivität zeigt a anVerzögerungPhase, deren Länge von der Proteinkonzentration abhängt, was darauf hindeutet, dass HK ein hysteretisches Enzym ist. Das hysteretische Verhalten kann auf langsame Änderungen in der Konformation von zurückgeführt werdenT. cruziHK als Reaktion auf Schwankungen der Glukose- und ATP-Konzentrationen in der glykosomalen Matrix. Schwankungen in den Substratkonzentrationen von HK innerhalb der Glykosomen können auf Schwankungen in der Umgebung des Trypanosoms zurückzuführen sein. Das hysteretische und kooperative Verhalten des Enzyms kann eine Form der Regulierung sein, durch die sich der Parasit leichter an diese Umweltveränderungen anpassen kann, die in jedem seiner Wirte oder in der frühen Phase des Übergangs zu einem neuen Wirt auftreten.
Einführung
Von der Chagas-Krankheit sind 9 Millionen Menschen in Lateinamerika und einige Hunderttausend Menschen in einigen anderen Ländern der Welt betroffen [1].Trypanosoma cruzi, der Erreger dieser potenziell tödlichen Krankheit, gehört zur Protistengruppe der Kinetoplastea. Der Parasit durchläuft in seinem Lebenszyklus drei verschiedene Phasen. Da es zyklisch zwischen einem Säugetier und einem wirbellosen Wirt übertragen wird, trifft es auf unterschiedliche Umgebungen [2]. Diese Parasiten zeichnen sich durch die Kompartimentierung einiger ihrer wichtigsten Stoffwechselwege in peroxisomenähnlichen Organellen namens Glykosomen aus. Insbesondere findet der Großteil der Glykolyse innerhalb der Glykosomen statt, einschließlich des ersten Schritts auf diesem katabolen Weg von Glukose, katalysiert durch Hexokinase (HK) [3], [4], [5]. Dieses Enzym gilt als potenzielles Angriffsziel für Medikamente, da es Glucose-6-phosphat erzeugt, das gemeinsame Substrat für die Glykolyse und den Pentose-Phosphat-Weg, Stoffwechselprozesse, die für die Produktion von ATP bzw. NADPH für die Zelle wichtig sind. HK wird in allen ausgedrücktT. cruziLebenszyklusstadien [6], [7], [8].
HK wurde in vielen Organismen, Eukaryoten und Prokaryoten, biochemisch charakterisiert, und für die meisten von ihnen wurde berichtet, dass seine Aktivität durch verschiedene Metaboliten über unterschiedliche Mechanismen reguliert wird. Die spezifische Aktivität und das kinetische Verhalten von HK wurden ebenfalls für beide beschriebenT. cruziund für einige andere Kinetoplastea, wieTrypanosoma bruceiUndLeishmania mexicana[9], [10], [11], [12], [13]. Im Gegensatz zur HK vieler anderer Organismen nimmt die Aktivität des Enzyms abT. cruziund verwandte Parasiten wird nicht durch seine Produkte Glucose-6-phosphat und ADP reguliert, es wurde jedoch festgestellt, dass PPi eine regulatorische Wirkung auf die HK von Trypanosomatiden hat, wenn auch bei jeder Art auf unterschiedliche Weise [10], [12], [13], [14].
Darüber hinaus wurde gezeigt, dass HKs von Hefe und Weizenkeimen ein hysteretisches Verhalten zeigen [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Diese Enzyme reagieren (im Hinblick auf einige ihrer kinetischen Eigenschaften) langsam auf eine schnelle Änderung der Konzentration eines Liganden, entweder eines Substrats oder eines Effektors. Solche langsamen Veränderungen, definiert durch ihre Geschwindigkeit im Verhältnis zur gesamten katalytischen Reaktion, führen zu einer Verzögerung in der Reaktion des Enzyms auf die veränderte Ligandenkonzentration. Hysterese kann durch Konformationsänderungen, Dissoziations-Additions-Reaktionen oder die Verdrängung eines Substrats durch ein anderes verursacht werden [22], [23]. Das Substrat verschiebt entweder das Gleichgewicht in Richtung eines bereits bestehenden zusätzlichen Zustands oder induziert das Vorhandensein eines neuen Zustands. Hysterese kann sowohl bei oligomeren als auch bei monomeren Enzymen auftreten und zu einem Übergang führen, der im Zeitrahmen der Messungen langsam abläuft. Es wurde vorgeschlagen, dass langsame Konformationsübergänge eine dynamischere Rolle in der Funktion von Enzymen spielen könnten als oft angenommen, was die Komplexität der Bewegungen in Enzymstrukturen auf verschiedenen Zeitskalen unterstreicht [22], [24]. Der mögliche Zusammenhang zwischen der Hysterese von Enzymen und ihrer Rolle bei der Regulierung komplexer Stoffwechselprozesse wurde im Hinblick auf die Tatsache interpretiert, dass die langsame Reaktion des hysteretischen Enzyms auf Änderungen der Ligandenspiegel zu einer zeitabhängigen Pufferung einiger Metaboliten führt die Bedeutung dieses Phänomens für die Verteilung von Flüssen über Pfade, die gemeinsame Zwischenprodukte nutzen oder mehrere Verzweigungspunkte enthalten [22], [24].
In diesem Artikel geben wir Beweise für das hysteretische Verhalten vonT. cruzi's HK, als möglicher Regulierungsmechanismus. Dieses Enzym zeigt eine langsame kinetische Reaktion als Folge von Schwankungen der Glukose-, ATP- und Enzymkonzentrationen und eines kooperativen Verhaltens im Zusammenhang mit Enzymkonzentrationen. Dieses Phänomen, definiert als eine zeitliche Verzögerung der Produktakkumulationsrate, war in jeder der analysierten Enzymproben vorhanden, sowohl in gereinigten nativen HK-Präparaten als auch in einer mit Glykosomen angereicherten Zellfraktion. Da über solche hysteretischen Eigenschaften für Enzyme berichtet wurde, die eine wichtige Rolle bei der Pufferung von Schwankungen des Substratspiegels spielen, schlagen wir vor, dass im Fall vonT. cruziHK, es könnte mit einer regulatorischen Wirkung verbunden sein, die dem Stoffwechsel des Parasiten innewohnt.
Abschnittsausschnitte
Parasiten
Epimastigoten vonT. cruziStamm EP (isoliert aus einem Patienten mit Chagas-Krankheit in der akuten Phase im Jahr 1967) wurden bei 28 °C in LIT-Medium (Leberinfusions-Tryptose) kultiviert, das mit 5 % inaktiviertem fötalem Rinderserum ergänzt war, wie zuvor beschrieben [25]. Die Parasiten wurden in der exponentiellen Wachstumsphase mit einer optischen Dichte von 0,8 bei 600 nm geerntet.
Reinigung derT. cruziHexokinase aus einer mit Glykosomen angereicherten Fraktion, die durch subzelluläre Fraktionierung gewonnen wird
Die subzelluläre Fraktionierung durch Differentialzentrifugation wurde nach Abrieb einer dichten Trypanosomensuspension mit Siliciumcarbid durchgeführt
Charakterisierung derT. cruziHK-Lag-Phase; Einfluss der Konzentration des Enzyms, seiner Substrate und des pH-Werts
Als die Zeitabhängigkeit der Hexokinase-Aktivität in einem kontinuierlichen Assay gemessen wurde, zeigte sich eine deutliche Verzögerung (Verzögerung) von mehreren Minuten war erkennbar, bevor ein stabiler Zustand erreicht wurde. Dieses Verhalten wurde bei jedem der untersuchten Enzympräparate beobachtet, sowohl bei HKp als auch bei GEF (Abb. 1). Die Vorinkubation des Enzyms mit jedem Substrat (Glucose und ATP) separat für 5 Minuten hatte keinen Einfluss auf das AuftretenVerzögerungPhase.Ja(T) Werte (die Zeit, die das Enzym benötigt, um die Steady-State-Aktivität zu erreichen)
Diskussion
Hysterese wurde für viele Organismen als Mechanismus beschrieben, der an der Regulierung wichtiger Stoffwechselwege beteiligt ist [22], [23]. Beispielsweise wurde bereits früher berichtet, dass das erste Enzym, HK, bei der Glykolyse in Hefe und Weizenkeimen ein hysteresisches Verhalten zeigt [16], [17], [18], [21]. InT. cruzihysteretisches Verhalten wurde bisher nur für das zytosolische NADP-abhängige Äpfelsäureenzym II beschrieben [30]. In dieser Arbeit haben wir das gezeigtT. cruziHK ist auch ein hysteretisches Enzym. Das war
Danksagungen
Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt vonRat für wissenschaftliche, humanistische, technologische und künstlerische Entwicklung(CDCHTA-ULA) von Projekt C-1726-11-03-B undWissenschaftsmission (FONACIT)von Projekt 20007001425. Die Autoren danken Dr. Paul Michels (Universität Edinburgh) für die anregenden Diskussionen und die kritische Lektüre des Manuskripts.
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Zitiert von (6)
Proteomische Analyse von Glykosomen aus Epimastigoten von Trypanosoma cruzi
2019, Molekulare und biochemische Parasitologie
Zitatauszug:
Die Proteinkonzentration wurde nach der Methode von [31] unter Verwendung des Bio-Rad Bradford-Proteinassays bestimmt. Die Aktivitäten von Hexokinase (HK) und Glutamatdehydrogenase (GDH) wurden spektrophotometrisch gemäß [32] bzw. [33] untersucht. Die Aktivitäten wurden in einem Hewlett-Packard 8452 Diodenarray-Spektrophotometer bei 340 nm und 28 °C in Gegenwart von 0,1 % (v/v) Triton X-100 und 150 mM NaCl gemessen, um die Membran zu solubilisieren und Latenz zu beseitigen.
InTrypanosoma cruzi, dem Erreger der Chagas-Krankheit, sind die ersten sieben Schritte der Glykolyse in Glykosomen unterteilt, bei denen es sich um authentische, aber spezialisierte Peroxisomen handelt. Neben der Glykolyse wurde berichtet, dass die Aktivität von Enzymen anderer Stoffwechselprozesse in Glykosomen vorhanden ist, wie z. B. der β-Oxidation von Fettsäuren, der Purinrückgewinnung, dem Pentose-Phosphat-Weg, der Gluconeogenese und der Biosynthese von Etherlipiden, Isoprenoiden, Sterinen und Pyrimidinen. In dieser Studie haben wir Glykosomen gereinigtT. cruziEpimastigoten sammelten die löslichen und Membranfraktionen dieser Organellen und trennten periphere und integrale Membranproteine durch Na2CO3Behandlung und osmotischer Schock. Für jede dieser Fraktionen wurde eine Proteomanalyse durchgeführt, die es uns ermöglichte, das Vorhandensein von Enzymen zu bestätigen, die an verschiedenen Stoffwechselwegen beteiligt sind, und neue Komponenten der Glykosomen dieses Parasiten zu identifizieren.
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Risikofaktoren der Mortalität nach Lebertransplantation in Uruguay
Transplantation Proceedings, Band 50, Ausgabe 2, 2018, S. 499–502
Die Identifizierung prädiktiver Mortalitätsfaktoren in einem Lebertransplantationsprogramm (LT) optimiert die Patientenauswahl und Organzuteilung.
Bestimmung der Überlebensraten und prädiktiven Faktoren der Mortalität nach LT im Nationalen Lebertransplantationsprogramm von Uruguay.
Es wurde eine retrospektive Studie durchgeführt, in der prospektiv gesammelte Daten in einer multidisziplinären Datenbank analysiert wurden. Alle Patienten, die seit Beginn des Programms im Juli 2009 bis April 2017 transplantiert wurden, wurden eingeschlossen (n = 148). 29 Faktoren wurden mit dem univariaten Kaplan-Meier-Modell analysiert. In der multivariaten Analyse wurde ein Cox-Regressionsmodell verwendet, um die unabhängigen Prognosefaktoren für das Überleben zu identifizieren.
Die Gesamtüberlebensrate betrug 92 %, 87 % bzw. 78 % bei der Entlassung, 1 Jahr bzw. 3 Jahre. Die Kaplan-Meier-Überlebenskurven waren signifikant niedriger bei: Empfängern im Alter von > 60 Jahren, Modell für End-Stage Liver Disease Score > 21, LT aufgrund von hepatozellulärem Karzinom (HCC) und akutem Leberversagen (ALF), Spendern mit Komorbiditäten, intraoperativem Blut Verlust über dem Medianwert (>2350 ml), Erythrozytentransfusionsbedarf über dem Medianwert (>1254 ml), intraoperative Komplikationen, Verzögerung der Extubation, invasive bakterielle und Pilzinfektion nach LT und Aufenthalt auf der Intensivstation >4 Tage. Das Cox-Regressionsmodell (Likelihood-Ratio-Test,P= 1,976 e−06) identifizierte die folgenden unabhängigen Prognosefaktoren für das Überleben: LT für HCC (Hazard Ratio [HR] 4,511;P= .001) und ALF (HR 6.346;P= .004), Spender mit Komorbiditäten (HR 2.354;P= .041), intraoperative Komplikationen (HR 2.707;P= .027) und invasive Pilzinfektionen (HR 3.281;P= .025).
Die Überlebensraten von LT-Patienten sowie die mit der Mortalität verbundenen Faktoren ähneln denen in der internationalen Literatur.
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